Ex Vivo Eye Irritation Test (EVEIT)

ACTO schafft Alternativen zum Tierversuch
3R-Prinzip: Replace, Reduce, Refine

Testprinzip

Mittels des EVEIT Prüfstandes wird insbesondere der allgemein anerkannten ethischen Notwendigkeit für Alternativen zum Tierversuch Rechnung getragen.

Dieses Ziel einer "humanen Wissenschaft" (Rex Burch) wurde vom Zoologen William Russel und dem Mikrobiologen Rex Burch erstmals 1959 in ihrem Buch "The Principles of Humane Experimental Technique" formuliert und ist heute als 3R-Prinzip bekannt(=Replace: Ersatz von Tierversuchen durch Alternativen, Reduce: Reduktion der Zahl von Versuchstieren, Refine: Verringern des Leidens von Versuchstieren durch schonendere, weniger belastende und aussagekräftigere Versuche).

Auf der Basis einer Kombination aus Hornhautkultur und bildgebender Analytik möchte ACTO e.V. ein Verfahren etablieren, das eine innovative und universelle Plattform für alternative tierversuchsfreie Forschung bildet und vorgeschriebene Untersuchungen im Rahmen der neuen EU-Chemikalienverordnung (REACH) und der EU-Direktive zur Bewertung von Kosmetika und Pharmaka erlaubt.
Der EVEIT-Prüfstand ersetzt Tierversuche, liefert verbesserte Ergebnisse und kann Tierversuche insgesamt reduzieren.

Der EVEIT Prüfstand liefert detailliertere und reproduzierbarere Ergebnisse als der Tierversuch und kann somit Tierversuche in der Augenheilkunde und Toxikologie (DRAIZE Test) insgesamt reduzieren und ersetzen. Augen von Schlachtkaninchen werden so behandelt, dass sie für einige Wochen kultiviert werden können. Damit ist eine Methodik verfügbar, die Versuche am lebenden Tier entbehrlich macht und das bei gleichwertiger bzw. sogar deutlich besserer Aussagekraft.
Wesentliches Kriterium dieser Methode ist die Heilung von Wunden und chemischen Verletzungen in vitro

Die so an der Hornhaut durchgeführten Versuche dienen dem Ziel, die Wirkung, Verträglichkeit und Nebenwirkungen wie z.B. Verkalkungen durch phosphathaltige Augentropfen vor der Anwendung am Menschen zu erkennen.
Während dieser Untersuchungen kann die Hornhaut jederzeit mikroskopisch und biochemisch beurteilt und Längsschnittbetrachtungen über die Zeit vorgenommen werden. Mit diesem Prüfstand lassen sich kleinste Veränderungen aufspüren, die beim Menschen erst nach Jahren zu Veränderungen des Auges führen.

Durch die Kombination des biologischen EVEIT Prüfstandes mit der Optischen Kohärenztomographie (OCT), die seitens des Instituts für Halbleitertechnik an der RWTH Aachen (IHT) in einem gemeinsamen Forschungsprojekt (siehe 2. Förderung BMBF) eingebracht wurde, steht ein weiteres nicht invasives Analyseverfahren zur Verfügung, mit dem minimalste Veränderungen an der Hornhaut in vitro dargestellt werden können. ACTO e.V. und das IHT wurden mit verschiedenen Preisen für diese neue Methode als Alternative zu Tierversuchen ausgezeichnet.

LESEN Ersatz für Tierversuche: Wissenschaftspreis geht nach Aachen

Ex Vivo Eye Irritation Test (EVEIT) bedeutet:

  • Aussagekräftiger als der unspezifische DRAIZE Test
  • Standardisierte Expositionen
  • Reproduzierbare Ergebnisse
  • Höchste Präzision der Analytik
  • Prädiktive Ergebnisse
  • Heilung und Freisetzung von Entzündungsbotenstoffen

Wirkungen am Auge lassen sich unterteilen in:

  • Pharmazeutische Wirkungen auf das Auge
  • Akute Veränderung durch Gifte, ätzende Substanzen, mechanische und physikalische Einwirkung
  • Längerfristige Veränderungen nach ein- und mehrmaligem Kontakt
  • Mikrobiologische Einwirkungen.

Derzeit werden Tierversuche durchgeführt, um Medikamente, Medizinprodukte und Chemikalien auf ihre Verträglichkeit zu prüfen. Ersatzverfahren existieren zwar, weisen aber nur akute Toxizität nach.

Es fehlt ein Verfahren, das

  • chronische Toxizität,
  • wiederholte Applikation,
  • Bewertung des Spätschadens und
  • eine mögliche Heilung darstellen kann.

Im Prüfstand EVEIT-acute sind Trübungen der Hornhaut, Veränderungen der Oberfläche und der tiefen Hornhaut durch spezielle Untersuchungsmethoden (Mikroskopie, OCT, Biochemie und Histologie) nachweisbar. Längerfristige Veränderungen nach solch einem einmaligen Kontakt und insbesondere die Frage, ob sich das Gewebe noch einmal regenerieren kann, lassen sich nur dann beurteilen, wenn die Hornhaut weiter am Leben erhalten wird.

Dies gelingt im EVEIT-long term Prüfstand bis zu 20 Tage. Die Hornhaut wird in einer speziellen, dem Auge nachempfundenen Kammer mit Nährmedium versorgt und feucht gehalten. Unter diesen Bedingungen zeigt sich bei ein- oder auch mehrmaligen Kontakten mit Substanzen, ob die Hornhaut komplett, nur der Defekt heilt oder ob keine Heilung der Hornhaut erfolgt.

Bei mehrfachem Kontakt der Hornhaut mit einer Substanz, wie dies z.B. typischerweise bei Augentropfen, aber auch bei Kosmetika der Fall ist, stellt sich die Frage, wie die Hornhaut reagiert. Hier sagt ein einmaliger Kontakt nicht all das aus, was für den nachher betroffenen Patienten oder Menschen von Wichtigkeit ist.

Im EVEIT Prüfstand können über mehrere Tage bis zu 100 Applikationen einer Substanz pro Tag auf eine Hornhaut aufgetragen werden. Dies wäre im Tierversuch oder gar im Versuch am Probanden niemals möglich. Somit lässt sich im EVEIT Prüfstand eine zeitlich komprimierte Reaktion auf chronische Reize darstellen.

Im EVEIT-multi local Prüfstand lassen sich alle Untersuchungen zu chronischer und akuter Gefährlichkeit von chemischen Stoffen auf einer Hornhaut miniaturisiert an verschiedenen Stellen der Augenoberfläche testen. So können mehrere Testungen auf einem Auge zusammengefasst werden. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, eine Referenzsubstanz sowie verschiedenartige Substanzen oder verschiedene Konzentrationen einer einzigen Substanz in einem Ansatz auf dem Auge zu testen.
Mit diesem Ansatz lassen sich große Versuchsserien kondensieren und intern referenzieren. Die vorhandene Individualität eines jeden Hornhautexplantates wird damit gleichzeitig zur Referenz und Vergleiche der Schwere einer Schädigung innerhalb eines einzigen Hornhautabschnittes sind systematisch darstellbar.

Dies führt zu einer Vereinfachung und Beschleunigung des Testverfahrens.
Mögliche Tests im EVEIT Prüfstand sind multilokale Expositionen, Augentropfapplikationen, Applikationen von niedrig- oder hochdosierten wiederkehrenden chemischen Substanzen, Flüssigkeiten, Gasen, aber auch Partikeln.

WEITERLESEN Beispiele der hier genannten Effekte: EVEIT-Grundlagen Publikation ATLA 2010, ATLA 2015

Verwendete Methoden

Für alle im EVEIT Prüfstand geplanten und durchgeführten Versuche werden frisch entnommene Augen von toten Kaninchen aus einer Kaninchenschlachterei verwendet.

Für den EVEIT-acute Versuch werden die frisch entnommenen Kaninchenaugen in einen Halter eingespannt und mit den entsprechenden chemischen Substanzen in Kontakt gebracht. Danach wird mittels Mikroskopie und Optischer Kohärenztomographie das Auge und seine Reaktion auf die chemische Substanz genau beobachtet.

Im EVEIT-long-term werden die Hornhäute aus den frisch entnommenen Kaninchenaugen heraus präpariert und in eine künstliche Augenkammer übernommen. In dieser Kammer werden sie ernährt und mikroskopisch überwacht.
Nach 24 Stunden wird der Zustand der Hornhaut anhand von biochemischen Messwerten, der Prüfung auf Klarheit, Stabilität des Epithels (äußere Deckschicht) und Funktionalität des Endothels (innere Deckschicht) überprüft. Erst wenn diese Kriterien, die eindeutige Rückschlüsse auf eine gesunde Hornhaut geben, erfüllt sind, können die Hornhäute für 3 bis 20 Tage in einem Inkubator den speziellen Tests unterzogen werden.

Während dieser Untersuchungen kann die Hornhaut wiederholt mikroskopisch beurteilt und mittels OCT Längsschnittbetrachtungen über diese Zeit vorgenommen werden. Mit diesem EVEIT Prüfstand lassen sich kleinste Veränderungen aufspüren, die beim Menschen erst nach Jahren zu Veränderungen des Auges führen.
Die Möglichkeit, innerhalb kurzer Zeit extrem viele Applikationen durchzuführen, führt zu einer zeitrafferartigen Herstellung von Effekten an der Hornhaut.

In vielen Experimenten und Publikationen können wir diese Effekte belegen. Das Projekt wird derzeit für die Validierung zum Ersatz von Tierversuchen bei der Europäischen Kommission zur Validierung von alternativen Methoden (European Centre for the Validation of Alternative Methods = ECVAM) vorbereitet.

Hornhautentzündung

ACTO e.V. entwickelt den EVEIT Prüfstand z.Zt. dahingehend weiter, dass gezeigt werden kann, dass eine induziert entzündete Hornhaut geheilt werden kann.

Simulation des Trockenen Auges

ACTO e.V. entwickelt den EVEIT Prüfstand z.Zt. dahingehend weiter, dass eine Simulation des "Trockenen Auge-Syndroms" möglich wird und unter diesen Bedingungen die gleichen Experimente wie oben dargestellt durchgeführt werden können.

Rückschau: Bisherige wichtige Projekte bei der Entwicklung des EVEIT Prüfstandes

An der Entwicklung des EVEIT Prüfstandes zum Tierersatzversuchsverfahren haben maßgeblich die folgenden beiden Projekte mit beigetragen:

  • BMBF-Förderung

    Das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) förderte das Projekt REACT – "Rating Eye exposure by an Advanced self-healing Culture Test" in den Jahren 2010 und 2011. Die tierversuchsfreie Testung von Chemikalien am Auge wurde in diesem Projekt weiterentwickelt. Der in den letzten 10 Jahren gemeinsam mit der Universitätsaugenklinik an der RWTH Aachen entwickelte und publizierte Laborprototyp des Ex Vivo Eye Irritation Tests (EVEIT) sollte innerhalb des Projektes mit kompetenten Partnern zu einem industriell anwendbaren und behördlich anerkannten Verfahren weiterentwickelt werden.

    Das Institut für Halbleitertechnik an der RWTH Aachen (IHT) steuerte diesem Projekt ein spezielles optisches Verfahren bei, die Optische Kohärenztomographie (OCT). Mit diesem Messverfahren ist eine objektive Dokumentation und Quantifizierung der Auswirkung von Chemikalien auf die Hornhaut erstmals möglich. Damit wird die subjektive Bewertung von Tieraugen durch objektive Laborparameter ersetzt.

    Mit der Innolabtec GmbH befand sich ein Partner im Projekt, der sich exzellent mit Steuerung, Automatisierung und Roboterentwicklung für labortechnische Prozesse auskennt. Damit können die bisher im Labor konzipierten Einzelkomponenten des EVEIT in einen technisch ausgewogenen und ablaufsicheren Prozess überführt werden.

    Die Fördergelder in Höhe von etwa 500.000 Euro haben in einer Serie von wiederholten Experimenten an 32 Referenzsubstanzen, welche von einem Beirat aus Industrie, ECVAM, Bundesanstalt für Risikobewertung (BfR) und Forschungseinrichtungen bestimmt wurden, neue Ergebnisse zur Reaktion innerhalb des Testsystems erbracht. Insgesamt hat das Testsystem eine hohe Voraussagesicherheit in der Beurteilung von Chemikalien in ihrer Wirkung auf das Auge. Die Einstufung in Kategorie I, II und III nach dem Global armonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS, englisch: Globally Harmonized System of Classifikation) wurde in 27 von 32 Substanzen richtig vorhergesagt, in 5 Fällen war der Test noch unterprädiktiv.

    Im Projekt konnte die Entwicklung vereinfachter Präparations- und Analyseverfahren im EVEIT Prüfstand vorangetrieben werden.

  • Untersuchung kosmetischer Produkte (Colipa)

    Ex-vivo-Versuche für Kosmetika

    Tierversuchsfreie Experimente sollen Kosmetika Tests am lebenden Tier ablösen. Colipa, der Dachverband der europäischen Kosmetikhersteller (Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association) lässt vor dem Hintergrund des 2009 greifenden Tierversuchsverbotes in der EU durch Spitzenwissenschaftler Alternativmethoden erforschen.

    Das Colipa-Projekt, das von ACTO e. V. in Kooperation mit der Uniklinik RWTH Aachen verfolgt wurde, ist ein Schlüsselprojekt für die gesamte Verätzungsforschung. ACTO konnte im Rahmen dieses Projektes ein neues System mit isolierten Kaninchenaugen entwickeln, welches Heilung, pathologische Heilung und die Reaktion des Auges auf wiederholte Anwendung von Substanzen nachweisen kann. Damit kann in naher Zukunft der für das lebende Tier schmerzhafte DRAIZE-Test abgelöst werden. Die für die Tests eingesetzten Hornhäute stammen von Schlachttieren, die nicht eigens zu diesem Zweck getötet werden.

    Dieses System mündet in einer stark weiterentwickelten Version im Ex Vivo Eye Irritation Test (EVEIT):

    • Im bisherigen Verlauf der Tests ist nachgewiesen worden, dass der Heilungsprozess des Hornhautepithels als kritischer Faktor bei Augenreizungen messbar ist.
    • Monitoring von Glukose, Laktat und pH-Wert geben verlässliche Gewissheit über das Überleben der Hornhäute im Kultursystem.
    • Die Menge der Entzündungsbotenstoffe konnte in Proportion zu den Konzentrationen von Reizstoffen gesetzt werden.
    • Die Hornhaut überlebte auch wiederholte Expositionen ex vivo in der Kulturkammer.
    • Die Heilung des Hornhautepithels ist eine entscheidende Größe in der Beurteilung der Toxizität von neuen Substanzen.

    ACTO e.V. ist davon überzeugt, dass die Experimente an Kaninchen-Hornhäuten im Kultursystem, möglicherweise kombiniert mit der Array-Technik an menschlichen Hornhäuten, die sich nicht für die Transplantation eignen, aber für die Forschung zur Verfügung stehen, zu einem System führen werden, das den Draize-Test ersetzen kann, indem es Vorhersagen über den Verlauf von Schädigungen des Auges bei Reizungen und Verätzungen durch chemische Substanzen erlaubt.

Ergebnisse

Heilung

Heilungsverlauf

Mikroskopische Beobachtung der korneo-epithelialen Heilung nach mechanischer Verletzung über 3 Tage.
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ISOT

Freisetzung von VEGF

Freisetzen von VEGF als Entzündungsmarker nach Verätzung mit 3% H2O2, 2M NaOH und 10% Tomadol 14-5 vs. Kontrolle ohne Trauma.

Kamera

OCT

Struktur- und Dickenanalyse der Kornea im EVEIT-System mittels Optischer Kohärenztomographie OCT.
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Weiterführende Informationen